Die Erfindung betrifft die biotechnologische Herstellung von Acrylsäure und verwandten Verbindungen sowie Mittel und Organismen, welche zur Verwendung dazu geeignet sind.

Acrylsäure ist ein wichtiger Ausgangsstoff bei der Herstellung von polymeren Verbindungen wie Kunststoffe. Acrylsäure wird bekanntermaßen in klassischen chemischen Verfahren, vor allem durch die zweistufige Oxidation von Propen, hergestellt. Bisher bekannte biotechnologische Alternativen zur Herstellung von Acrylsäure, beispielsweise mittels Laktat oder Propionat als Reaktionszwischenprodukte, erzielen vor allem aufgrund der ungünstigen thermodynamischen Eigenschaften der finalen Produktbildungsreaktion geringe reale Ausbeuten.

Es besteht der Bedarf an einem verbesserten Weg zur Herstellung von Acrylsäure, besonders an einem Verfahren zur Gewinnung von Acrylsäure aus gut verfügbaren Substraten und über biotechnologische Verfahren mit hoher realer Ausbeute.

Aus der Publikation Xu, X et al. Chinese J. Chem. Eng. (2006) 14(4): 419–427 ist ein biotechnologisches Verfahren zur Produktion von Acrylsäure, ausgehend von Lactyl-CoA unter Einsatz des Enzyms Lactyl-CoA Dehydratase bekannt. Aus Nossal, PM Biochem. J. (1952) 50: 349–355, ist ein Decaboxylasesystem von Lactobacillus bekannt, womit Fumarat zu Lactat und CO2 umgesetzt wird. Aus Wagner S et al., Nachwachsende Rohstoffe für die chemische Industrie, In: Berichte aus Energie und Umweltforschung 30/2005 (Hrsg.: Bundesministerium für Verkehr, Innovation und Technologie der Bundesrepublik Österreich) Seite 54–55, ist die enzymatische Umwandlung von Milchsäure zu Acrylsäure beschrieben.

Der Erfindung liegt somit das technische Problem zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Acrylsäure sowie Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens bereitzustellen. Das technische Problem besteht auch darin, ein Verfahren bereitzustellen, welches besonders bei bekannten und in biologisch/fermentativen Prozessen verwendeten und etablierten Mikroorganismen bzw. Zelllinien eingesetzt werden kann, welche meist mittels üblicher und etablierter Rekombinationstechnologien in an sich bekannter Weise und unter geringem Aufwand transfiziert und kultiviert werden können. Weiter soll das technische Problem gelöst werden, biotechnologische Prozesse zur Synthese der Acrylsäure einsetzbar zu machen, die auch außerhalb einer intakten biologischen Zelle ablaufen können.

Das zugrunde liegende technische Problem wird primär gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von Acrylsäure, wobei, in einem bevorzugt letzten Schritt des Synthesewegs, Fumarsäure in Acrylsäure umgesetzt wird.

Die Erfindung stellt dazu ein Verfahren bereit, worin Fumarsäure oder Fumarat durch Abspaltung einer Carboxylgruppe, die vorzugsweise als CO2-Rest abgeht, in Acrylsäure oder Acrylat umgesetzt wird. Die Decarboxylierung wird erfindungsgemäß katalysiert durch eine oder mehrere Decarboxylase-Aktivitäten. Diese sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
4-Oxalocrotonat-Carboxy-Lyase (EC 4.1.1.77),
Aminocarboxymuconat-semialdehyd-Decarboxylase (ACMSD) (EC 4.1.1.45),
5-Oxopent-3-en-1,2,5-tricarboxylat-Decarboxylase (EC 4.1.1.68),
Dihydroxyphthalat-Carboxy-Lyase (EC 4.1.1.69),
Oxaloacetat-Carboxy-Lyase (EC 4.1.1.3),
Methylmalonyl-CoA-Decarboxylase (EC 4.1.1.41),
Dihydroxyphthalat-Decarboxylase (EC 4.1.1.55),
Uracil-5-Carboxylat-Carboxy-Lyase (EC 4.1.1.66) und
4-Hydroxyphenylacetat-Carboxy-Lyase (EC 4.1.1.83).

Die Erfindung betrifft auch Aktivitäten davon abgeleiteter modifizierter Enzyme, soweit der Fachmann diese ohne weiteres erfinderisches Zutun aus diesen konkret genannten Enzymen bereitstellen kann.

Besonders bevorzugt ist die ACMSD und davon abgeleitete Varianten, insbesondere Sequenzvarianten, mit erhöhter Substratspezifität für Fumarsäure/Fumarat.

Die Erfindung steht auch im Zusammenhang mit der Decarboxylase-Aktivität eines modifizierten Enzyms. Das Enzym weist bevorzugt mindestens eine Modifikation der Primärstruktur und bevorzugt der Tertiärstruktur des Enzymproteins auf. Diese Modifikation ist bevorzugt geeignet, die Substratspezifität in Bezug auf das Substrat Fumarsäure zu erhöhen. In einer Variante ist diese Modifikation bevorzugt, vorzugweise zusätzlich, geeignet, die Endprodukthemmung in Bezug auf Acrylsäure zu vermindern. In einer weiteren Variante ist diese Modifikation bevorzugt, vorzugweise zusätzlich, geeignet, die chemische und strukturelle Stabilität des Enzyms zu erhöhen. In einer weiteren Variante ist diese Modifikation bevorzugt, vorzugsweise zusätzlich, geeignet, die Temperaturstabilität des Enzyms zu erhöhen. Es versteht sich, dass Modifikationen im Sinne dieser Erfindung auch an bereits anderweitig abgewandelten oder modifizierten Enzymproteinen durchgeführt werden können. Diese Decarboxylase-Aktivität kann durch ein von bekannten Enzymen (siehe oben) abgeleitetes modifiziertes Enzym mit veränderter Substratspezifität realisiert werden, welche die Umsetzung der Fumarsäure zu Acrylsäure verbessert.

Die Erfindung sieht also vor, Acrylsäure biotechnologisch herzustellen, indem Acrylsäure durch Decarboxylierung von Fumarsäure durch mindestens eine Decarboxylase-Aktivität, erhalten wird. Die Erfinder fanden überraschend, dass der Vorgang der Decarboxylierung als die treibende Kraft des Acrylsäure-Stoffwechselwegs für eine hohe reale Produktausbeute sorgt.

Die erfindungsgemäße Methode erlaubt es, den letzten Reaktionsschritt ohne Co-Metabolite wie NADH oder Ferredoxin oder Co-Faktoren wie Co-Enzym A durchzuführen; sie ist daher besonders für eine extrazelluläre Biotransformation geeignet.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt außerdem die Verwendung milder Umgebungsbedingungen, das heißt geringe Temperatur und geringer Druck, was sich auf die mäßige chemische Stabilität der Acrylsäure und die reale Ausbeute günstig auswirkt. So kann vermieden werden, dass sich die gebildete Acrylsäure spontan in Nebenprodukte umwandelt, zum Beispiel Polymerisations-Produkte von Acrylsäure, die unter Umständen schon bei Temperaturen oberhalb von 25°C auftreten können.

Im Zusammenhang dieser Erfindung wird unter den Begriffen „Fumarsäure” und „Acrylsäure” regelmäßig auch Fumarat und Acrylat verstanden. Anhand der pKS-Werte (Fumarsäure: pKS1: 4,5, pKS2: 3,0; Acrylsäure: pKS: 4,25) und den jeweils herrschenden und pH-Werten und Konzentrationen kann der Fachmann ohne weiteres erkennen, ob und inwieweit die de-protonierten Formen vorliegen.

Eine bevorzugte Variante der Erfindung ist die Verwendung der Decarboxylase-Aktivität der 4-Oxalocrotonat-Carboxy-Lyase (EC 4.1.1.77) oder einer davon abgeleiteten Enzymaktivität, welche die Decarboxylierung des Substrats Fumarsäure zu Acrylsäure katalysieren kann, zur Herstellung von Acrylsäure. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 enthält oder daraus besteht. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt ein Enzymprotein, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 enthält oder daraus besteht. Besonders bevorzugt enthält das Enzymprotein eine von SEQ ID NO: 2 abgeleitete Sequenz oder ein Fragment davon, welche durch Modifikation, ausgewählt aus Deletion, Addition, Substitution oder Mutation, einer oder mehrerer, bevorzugt von 1 bis 10, Aminosäuren erhalten werden kann.

Eine weitere bevorzugte Variante der Erfindung ist die Verwendung der Decarboxylase-Aktivität der Aminocarboxymuconat-semialdehyd-Decarboxylase (EC 4.1.1.45), ACMSD, oder einer davon abgeleiteten Enzymaktivität, welche die Decarboxylierung des Substrats Fumarsäure zu Acrylsäure katalysieren kann, zur Herstellung von Acrylsäure. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 3 enthält oder daraus besteht. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt ein Enzymprotein, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4 enthält oder daraus besteht. Besonders bevorzugt enthält das Enzymprotein eine von SEQ ID NO: 4 abgeleitete Sequenz oder ein Fragment davon, welche durch Modifikation, ausgewählt aus Deletion, Addition, Substitution oder Derivatisierung, einer oder mehrerer, bevorzugt von 1 bis 10, Aminosäuren erhalten werden kann.

Eine weitere bevorzugte Variante der Erfindung ist die Verwendung der Decarboxylase-Aktivität der 5-Oxopent-3-en-1,2,5-tricarboxylat-Decarboxylase (EC 4.1.1.68) oder einer davon abgeleiteten Enzymaktivität, welche die Decarboxylierung des Substrats Fumarsäure zu Acrylsäure katalysieren kann, zur Herstellung von Acrylsäure. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5 enthält oder daraus besteht. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt ein Enzymprotein, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6 enthält oder daraus besteht. Besonders bevorzugt enthält das Enzymprotein eine von SEQ ID NO: 6 abgeleitete Sequenz oder ein Fragment davon, welche durch Modifikation, ausgewählt aus Deletion, Addition, Substitution oder Mutation, einer oder mehrerer, bevorzugt von 1 bis 10, Aminosäuren erhalten werden kann.

Eine weitere bevorzugte Variante der Erfindung ist die Verwendung der Decarboxylase-Aktivität der Dihydroxyphthalat-Carboxy-Lyase (EC 4.1.1.69) oder einer davon abgeleiteten Enzymaktivität, welche die Decarboxylierung des Substrats Fumarsäure zu Acrylsäure katalysieren kann, zur Herstellung von Acrylsäure. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 7 enthält oder daraus besteht. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt ein Enzymprotein, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 8 enthält oder daraus besteht. Besonders bevorzugt enthält das Enzymprotein eine von SEQ ID NO: 8 abgeleitete Sequenz oder ein Fragment davon, welche durch Modifikation, ausgewählt aus Deletion, Addition, Substitution oder Mutation, einer oder mehrerer, bevorzugt von 1 bis 10, Aminosäuren erhalten werden kann.

Eine weitere bevorzugte Variante der Erfindung ist die Verwendung der Decarboxylase-Aktivität der Oxaloacetat-Carboxy-Lyase (EC 4.1.1.3) oder einer davon abgeleiteten Enzymaktivität, welche die Decarboxylierung des Substrats Fumarsäure zu Acrylsäure katalysieren kann, zur Herstellung von Acrylsäure. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 9 enthält oder daraus besteht. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt ein Enzymprotein, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 10 enthält oder daraus besteht. Besonders bevorzugt enthält das Enzymprotein eine von SEQ ID NO: 10 abgeleitete Sequenz oder ein Fragment davon, welche durch Modifikation, ausgewählt aus Deletion, Addition, Substitution oder Mutation, einer oder mehrerer, bevorzugt von 1 bis 10, Aminosäuren erhalten werden kann.

Im Zusammenhang mit der Erfindung ist auch Acetoacetat-Decarboxylase (EC 4.1.1.4) oder eine davon abgeleitete Enzymaktivität zu nennen, welche die Decarboxylierung des Substrats Fumarsäure zu Acrylsäure katalysieren kann, zur Herstellung von Acrylsäure. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 11 enthält oder daraus besteht. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt ein Enzymprotein, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 12 enthält oder daraus besteht. Besonders bevorzugt enthält das Enzymprotein eine von SEQ ID NO: 12 abgeleitete Sequenz oder ein Fragment davon, welche durch Modifikation, ausgewählt aus Deletion, Addition, Substitution oder Mutation, einer oder mehrerer, bevorzugt von 1 bis 10, Aminosäuren erhalten werden kann.

Im Zusammenhang mit der Erfindung ist auch die 2,3-Dihydroxybenzoat-Decarboxylase (EC 4.1.1.46) oder eine davon abgeleitete Enzymaktivität zu nennen, welche die Decarboxylierung des Substrats Fumarsäure zu Acrylsäure katalysieren kann, zur Herstellung von Acrylsäure. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 13 enthält oder daraus besteht. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt ein Enzymprotein, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 14 enthält oder daraus besteht. Besonders bevorzugt enthält das Enzymprotein eine von SEQ ID NO: 14 abgeleitete Sequenz oder ein Fragment davon, welche durch Modifikation, ausgewählt aus Deletion, Addition, Substitution oder Mutation, einer oder mehrerer, bevorzugt von 1 bis 10, Aminosäuren erhalten werden kann.

Im Zusammenhang mit der Erfindung ist auch die Uroporphyrinogen-Carboxy-Lyase (EC 4.1.1.37) oder eine davon abgeleitete Enzymaktivität zu nennen, welche die Decarboxylierung des Substrats Fumarsäure zu Acrylsäure katalysieren kann, zur Herstellung von Acrylsäure. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 15 enthält oder daraus besteht. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt ein Enzymprotein, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 16 enthält oder daraus besteht. Besonders bevorzugt enthält das Enzymprotein eine von SEQ ID NO: 16 abgeleitete Sequenz oder ein Fragment davon, welche durch Modifikation, ausgewählt aus Deletion, Addition, Substitution oder Mutation, einer oder mehrerer, bevorzugt von 1 bis 10, Aminosäuren erhalten werden kann.

Eine weitere bevorzugte Variante der Erfindung ist die Verwendung der Decarboxylase-Aktivität der Methylmalonyl-CoA-Decarboxylase (EC 4.1.1.41) oder einer davon abgeleiteten Enzymaktivität, welche die Decarboxylierung des Substrats Fumarsäure zu Acrylsäure katalysieren kann, zur Herstellung von Acrylsäure. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 17 enthält oder daraus besteht. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt ein Enzymprotein, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 18 enthält oder daraus besteht. Besonders bevorzugt enthält das Enzymprotein eine von SEQ ID NO: 18 abgeleitete Sequenz oder ein Fragment davon, welche durch Modifikation, ausgewählt aus Deletion, Addition, Substitution oder Mutation, einer oder mehrerer, bevorzugt von 1 bis 10, Aminosäuren erhalten werden kann.

Eine weitere bevorzugte Variante der Erfindung ist die Verwendung der Decarboxylase-Aktivität der Dihydroxyphthalat-Decarboxylase (EC 4.1.1.55) oder einer davon abgeleiteten Enzymaktivität, welche die Decarboxylierung des Substrats Fumarsäure zu Acrylsäure katalysieren kann, zur Herstellung von Acrylsäure. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 19 enthält oder daraus besteht. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt ein Enzymprotein, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 20 enthält oder daraus besteht. Besonders bevorzugt enthält das Enzymprotein eine von SEQ ID NO: 20 abgeleitete Sequenz oder ein Fragment davon, welche durch Modifikation, ausgewählt aus Deletion, Addition, Substitution oder Mutation, einer oder mehrerer, bevorzugt von 1 bis 10, Aminosäuren erhalten werden kann.

Im Zusammenhang mit der Erfindung ist auch die Aryl-Methylmalonat-Decarboxylase (EC 4.1.1.76) oder eine davon abgeleitete Enzymaktivität zu nennen, welche die Decarboxylierung des Substrats Fumarsäure zu Acrylsäure katalysieren kann, zur Herstellung von Acrylsäure. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 21 enthält oder daraus besteht. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt ein Enzymprotein, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 22 enthält oder daraus besteht. Besonders bevorzugt enthält das Enzymprotein eine von SEQ ID NO: 22 abgeleitete Sequenz oder ein Fragment davon, welche durch Modifikation, ausgewählt aus Deletion, Addition, Substitution oder Mutation, einer oder mehrerer, bevorzugt von 1 bis 10, Aminosäuren erhalten werden kann.

Eine weitere bevorzugte Variante der Erfindung ist die Verwendung der Decarboxylase-Aktivität der Uracil-5-Carboxylat-Carboxy-Lyase (EC 4.1.1.66) oder einer davon abgeleiteten Enzymaktivität, welche die Decarboxylierung des Substrats Fumarsäure zu Acrylsäure katalysieren kann, zur Herstellung von Acrylsäure. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül, welches die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 23 enthält oder daraus besteht. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt ein Enzymprotein, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 24 enthält oder daraus besteht. Besonders bevorzugt enthält das Enzymprotein eine von SEQ ID NO: 24 abgeleitete Sequenz oder ein Fragment davon, welche durch Modifikation, ausgewählt aus Deletion, Addition, Substitution oder Mutation, einer oder mehrerer, bevorzugt von 1 bis 10, Aminosäuren erhalten werden kann.

Eine weitere bevorzugte Variante der Erfindung ist die Verwendung der Decarboxylase-Aktivität der 4-Hydroxyphenylacetat-Carboxy-Lyase (EC 4.1.1.83) oder einer davon abgeleiteten Enzymaktivität, welche die Decarboxylierung des Substrats Fumarsäure zu Acrylsäure katalysieren kann, zur Herstellung von Acrylsäure. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt kodiert durch ein oder mehrere der Nukleinsäuremoleküle, welche die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 und/oder SEQ ID NO: 29 enthalten oder daraus bestehen. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt ein Enzymprotein, welches aus einer oder mehreren Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 und/oder SEQ ID NO: 30 enthält oder daraus besteht. Besonders bevorzugt enthält das Enzymprotein eine von SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 und/oder SEQ ID NO: 30 abgeleitete Sequenz oder ein Fragment davon, welche durch Modifikation, ausgewählt aus Deletion, Addition, Substitution oder Mutation, einer oder mehrerer, bevorzugt von 1 bis 10, Aminosäuren erhalten werden kann.

Im Zusammenhang mit der Erfindung ist auch die 4-Hydroxybenzoat-Carboxy-Lyase (EC 4.1.1.61) oder eine davon abgeleitete Enzymaktivität zu nennen, welche die Decarboxylierung des Substrats Fumarsäure zu Acrylsäure katalysieren kann. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt kodiert durch ein oder mehrere der Nukleinsäuremoleküle, welche die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 und/oder SEQ ID NO: 35 enthalten oder daraus bestehen. Diese Decarboxylase-Aktivität ist bevorzugt ein Enzymprotein, welches aus einer oder mehreren Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34 und/oder SEQ ID NO: 36 enthält oder daraus besteht. Besonders bevorzugt enthält das Enzymprotein eine von SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34 und/oder SEQ ID NO: 36 abgeleitete Sequenz oder ein Fragment davon, welche durch Modifikation, ausgewählt aus Deletion, Addition, Substitution oder Mutation, einer oder mehrerer, bevorzugt von 1 bis 10, Aminosäuren erhalten werden kann.

In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung findet die enzymatisch katalysierte Umsetzung der Fumarsäure zu Acrylsäure im Anschluss an eine biotechnologische, bevorzugt fermentative Synthese von Fumarsäure, statt. Varianten der biotechnologischen Fumarsäure-Synthese sind sowohl die anaerobe als auch die aerobe Umsetzung. Bevorzugt wird zur fermentativen Synthese von Fumarat eine transgene Wirtszelle eingesetzt, welche einen gesteigerten Fumarsäure-Stoffwechsel aufweist (Fumarsäure-Überproduzent). Solche Fumarsäure-Überproduzenten sind in an sich bekannter Weise herstellbar und können ohne weiteres zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitgestellt werden.

Alternativ werden bekannte Mikroorganismen, die zur Fumarsäure-Synthese geeignet sind, eingesetzt. Bevorzugt sind hier vor allem Rhizopus-Arten, vorzugsweise ausgewählt aus R. nigricans, R. arrhizus, R. oryzae und R. formosa.

In einer bevorzugten Ausführung gibt die Fumarsäure produzierende Zelle die Fumarsäure in das umgebende (Kultur-)medium ab. Bevorzugt realisierte Wege sind dabei der Protonen-Symport, passive Diffusion, passive Carrier, primär-aktiver Transport, und/oder andere sekundär-aktive Transporte oder Symporte. In einer bevorzugten Variante dieses Erfindungsaspekts exprimiert der Fumarsäure-Überproduzent deshalb zusätzlich mindestens ein Protein, welches den Transmembrantransport der intrazellulär synthetisierten Fumarsäure vermittelt oder unterstützt.

Alternativ oder ergänzend wird die Wirtszelle zumindest kurzfristig Bedingungen ausgesetzt, welche die Integrität der Zellmembran, kurzzeitig und reversibel oder dauerhaft soweit aufhebt, dass ein Transmembrantransport vereinfacht, unterstützt oder ermöglicht wird. Solche Verfahren schließen die Elektroporation und die chemische und thermische Desintegration ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.

Die Fumarsäure kann in an sich bekannter Weise aus dem Kulturmedium isoliert und gegebenenfalls aufgereinigt werden.

Durch die bevorzugt vorgesehene Unterteilung der biotechnologischen Synthese von Acrylsäure in einem Teilschritt (a) der biotechnologischen Produktion von Fumarsäure innerhalb einer Wirtszelle und den zweiten Teilschritt (b) der Decarboxylierung von der Fumarsäure zur Acrylsäure, welche bevorzugt als extrazelluläre Biotransformation stattfindet (siehe unten), kann die toxische Wirkung des Endprodukts Acrylsäure auf die Fumarsäure produzierende Wirtszelle vermieden werden.

In einer anderen bevorzugten Ausführung der Erfindung wird die Fumarsäure klassisch chemisch synthetisiert und die erfindungsgemäße Decarboxylierung zu Acrylsäure findet im Anschluss an eine chemische Synthese von Fumarsäure statt.

In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung wird Fumarsäure außerhalb einer biologischen Zelle in einer sogenannten extrazellulären Decarboxylierung umgesetzt, wobei die Decarboxylase-Aktivität an einen Träger immobilisiert vorliegt. Dabei liegt das mindestens eine die Decarboxylase-Aktivität vermittelnde Enzym vorzugsweise außerhalb einer biologischen Zelle, entweder gelöst oder bevorzugt in an sich bekannter Weise immobilisiert auf einem Substrat vor. In dieser bevorzugten Variante der Erfindung wird die Fumarsäure bevorzugt gelöst in einer Trägerflüssigkeit, unmittelbar mit der Decarboxylase-Aktivität in Kontakt gebracht, so dass dort die erfindungsgemäße Decarboxylierung zu Acrylsäure stattfindet. Letztlich wird die so synthetisierte Acrylsäure in an sich bekannter Weise aus dem Trägermedium isoliert.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Acrylsäure, welches zumindest oder ausschließlich aus den Schritten besteht: Bereitstellen einer Wirtszelle, die geeignet ist, Fumarsäure zu synthetisieren, Kultivieren der Wirtszelle in Kulturmedium unter Bedingungen, unter denen Fumarsäure gebildet wird, gegebenenfalls Isolieren der Fumarsäure aus der Wirtszelle, und Inkontaktbringen der gebildeten Fumarsäure mit mindestens einer Decarboxylase-Aktivität, bevorzugt der vorstehend charakterisierten Decarboxylasen und modifizierender Varianten davon, unter Bedingungen, die eine Umsetzung der Fumarsäure in Acrylsäure ermöglichen oder fördern, wobei die Umsetzung bevorzugt außerhalb einer biologischen Zelle vorzugsweise an einem Biokatalysator, welcher die genannte Decarboxylase-Aktivität aufweist, stattfindet.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Biokatalysator zur Herstellung von Acrylsäure, bestehend aus oder zumindest enthaltend: mindestens einen Träger und daran immobilisiertes isoliertes Enzymprotein mit mindestens einer der vorstehend charakterisierten Decarboxylase-Aktivität.

Bevorzugt ist ein Biokatalysator, welcher mindestens ein enzymatisch aktives Poly-Aminosäuremolekül (Enzymprotein) aufweist, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) Aminosäuremolekülen, welche mindestens eine der Sequenzen, ausgewählt aus SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 18, 20, 24, 26, 28 und 30, enthalten, oder daraus bestehen, undb) daraus abgeleiteten oder modifizierten Aminosäuremolekülen oder Fragmenten, die mit den unter a) beschriebenen Aminosäuremalekülen zumindest 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr, Sequenzübereinstimmung aufweisen und die Decarboxylase-Aktivität kodieren.

Bevorzugte Aminosäuremoleküle der Erfindung enthalten zumindest eine der vorstehend näher charakterisierten Modifikationen und bilden somit modifizierte Enzymproteine.

Darunter werden auch sogenannte Proteinanaloge verstanden. Das sind im Rahmen dieser Erfindung Protein verwandte Moleküle, die mindestens eine nicht natürliche oder derivatisierte Aminosäure aufweisen, und allgemein alle Makromoleküle Polymere, die auf Aminosäuren aufgebaut sind und zur Bildung von Proteinstrukturen geeignet sind und Proteinfunktionen, also besonders Enzymfunktionen ausüben können.

Für technische Anwendungen ist der Einsatz zellfreier löslicher Enzyme zumeist ungünstig, da sie nicht oder nur schwer zurückgewonnen werden können. Daher ist es vorteilhaft, diese durch Immobilisierung in eine wieder verwendbare Form zu bringen. Die auf diese Weise fixierten Enzyme bieten dabei alle Vorteile der klassischen heterogenen Katalyse. Im Zusammenhang mit der Erfindung werden solche fixierten Enzyme auch als Biokatalysatoren bezeichnet. Sie sind beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation leicht zurückgewinnbar. Sie können in kontinuierlichen Verfahren als Schüttung in Festkörperreaktoren sowie in Fließbettreaktoren oder Rührreaktoren eingesetzt werden. Damit wird eine kontinuierliche Reaktionsführung möglich, die meist einfache technische Ausführungen mit einer weitgehenden Automatisierung verbindet. Die Enzyme lassen sich erfindungsgemäß bevorzugt immobilisieren, indem sie als gelöste Moleküle in einem definierten Raum, beispielsweise in Poren eines Trägermaterials, eingeschlossen werden oder indem sie in einen unlöslichen Zustand überführt werden.

Dem Fachmann sind Verfahren zur Enzymimmobilisierung bekannt. Bevorzugt sind Verfahren zur Anbindung an die Oberfläche eines Trägers, vorzugsweise durch Adsorption, ionische oder kovalente Bindung, und Quervernetzung mit dem Träger, die trägerfreie Quervernetzung sowie die Einschlussimmobilisierung, vorzugsweise Membraneinschluss und Geleinschluss. Der Fachmann kennt auch die Zusammenhänge zwischen Immobilisierung und Enzymaktivität. Um eine Verminderung der Enzymaktivität zu vermeiden oder zu kompensieren, verwendet er bekannte Maßnahmen. Bevorzugt werden modifizierte Enzymproteine eingesetzt, die durch die gewählte Immobilisierung keine oder nur eine unwesentliche Verlagerung oder Verminderung der katalytischen Aktivität erfahren. Bevorzugt wird die erfindungsgemäß bevorzugt vorgesehene Modifikation des Enzyms so gewählt, dass im Zusammenhang mit der Immobilisierung die angestrebte Verbesserung der Substratspezifität und/oder Stabilität des Enzyms erreicht wird.

Bevorzugt ist der Träger ausgewählt aus Matrices, Membranen, Gelen und porösen Strukturen, besonders Gewebe, Vliese, Polymermembranen und -gele, die geeignet sind, dass daran Enzymproteine mit mindestens einer Decarboxylase-Aktivität immobilisiert werde können. Bevorzugt natürliche organische Träger sind Polysaccharide wie Cellulose, Stärke, Dextran, Agarose oder Chitin. Proteine wie Kollagen, Gelatine oder Albumin sind ebenfalls bevorzugt. Bevorzugte synthetische organische Polymere sind Polyacrylate, Polymethacrylate, Polyacrylamide, Vinyl- und Allylpolymere, Polycarbonate sowie andere Polyester oder Polyamide. Bevorzugte anorganische Träger sind poröse Materialien vorzugsweise auf der Basis von Silizium- oder Aluminiumoxiden oder Gemischen daraus. Von besonderer Bedeutung ist die Porosität des Trägers. Poröse Träger verfügen über eine große Oberfläche für die Enzymimmobilisierung, so dass hohe Aktivitäten erzielt werden. Dabei sollen die Porenradien groß genug sein, um den Zugang für das Enzymprotein zu gewährleisten. Ein geringes Quellverhalten, gute chemische Stabilität gegenüber Säuren und Basen, eine gute mikrobiologische Stabilität und eine gute Druckfestigkeit sind weitere Voraussetzungen, die an die Trägermaterialien gestellt werden. Auch die an der Oberfläche zugänglichen funktionellen Gruppen spielen eine wesentliche Rolle.

Eine bevorzugte alternative Ausführung der Erfindung sieht eine direkte Synthese von Acrylsäure innerhalb eines rekombinanten Mikroorganismus oder transgenen Wirtszelle vor, die so genannte intrazelluläre Decarboxylierung. Die Wirtszelle ist zur Decarboxylierung von Fumarsäure befähigt, besonders aufgrund der Expression homologer oder heterologer Gene für Enzymaktivitäten der Fumarsäure-Synthese, und enthält erfindungsgemäß, bevorzugt zusätzlich, mindestens ein, bevorzugt heterologes, Nukleinsäuremolekül in exprimierbarer Form, vorzugsweise in Form einer oder mehrerer Expressionskassetten, im Genom und/oder auf einem Plasmid oder Vektor, welches mindestens eine Decarboxylase-Aktivität, besonders mindestens eine modifizierte Decarboxylase kodiert, wobei die Wirtszelle Decarboxylase-Aktivität exprimiert oder gegebenenfalls überexprimiert, beispielsweise dann, wenn eine homologe Decarboxylase-Aktivität in der Wirtszelle vorhanden ist. Gegenstand der Erfindung ist eine transgene Wirtszelle, die geeignet ist zur Herstellung von Acrylsäure, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass die Wirtszelle mindestens eine der vorstehend näher charakterisierten Decarboxylase-Aktivitäten exprimiert.

Bevorzugte Wirtszellen sind ausgewählt aus: E. coli-Stämmen, Pseudomonas-Stämmen, Rhizopus-Stämmen, vorzugsweise vorstehend genannten Fumarsäure-Produzenten und Clostridium-Stämmen. Bevorzugt sind Stämme mit hoher Acrylsäuretoleranz, vor allem mit mindestens einem eigenen Mechanismus zum Befördern der gebildeten Acrylsäure aus der Zelle heraus (Transmembrantransport), um die intrazelluläre Wirkung zu minimieren.

In einer bevorzugten Variante dieses Erfindungsaspekts exprimiert die zur Acrylsäurebildung aus Fumarat befähigte Wirtszelle zusätzlich ein primär-aktives, sekundär-aktives oder passives Transporter oder Symportersystem zum Transmembrantransport der intrazellulär synthetisierten Acrylsäure. Vermittelt durch ein zusätzliches vorgesehenes Transportsystem zum Ausschließen der Acrylsäure aus der Zelle, bevorzugt in Kombination mit einem Prozess zur Entfernung von Acrylsäure aus dem Kulturmedium, kann die Acrylsäure-Toleranz der Wirtszelle und die Ausbeute verbessert werden. Ohne an die Theorie gebunden sein zu wollen, ist die erzielbare Ausbeute über den erfindungsgemäß vorgesehenen Syntheseweg zur Herstellung von Acrylsäure vor allem durch deren toxische Wirkung auf die Wirtszellen limitiert.

Gegenstände der Erfindung sind auch eine Expressionskassette und deren Verwendung zur Transformation einer Wirtszelle. Die Expressionskassette enthält dabei mindestens ein vorstehend näher charakterisiertes Nukleinsäuremolekül, welches für eine der vorstehend näher charakterisierten Decarboxylase-Aktivitäten kodiert. Die Kassette weist mindestens einen Promotor und gegebenenfalls eine Terminationssequenz auf. Der Promotor ist bevorzugt konstitutiv. Der Promoter ist bevorzugt derart modifiziert, dass er eine Überexpression der kodierten Decarboxylase-Aktivität vermitteln kann. Modifizierte Promotoren sowie Verfahren zur Modifikation von Promotoren sind bekannt.

Gegenstände der Erfindung sind auch ein entsprechender Vektor, der geeignet ist, die Expression der Decarboxylase-Aktivität in einer Wirtszelle zu vermitteln, und dessen Verwendung zur Transformation einer Wirtszelle, welcher die vorstehend näher charakterisierte Expressionskassette enthält.

Die Erfindung betrifft schließlich auch die Verwendung der vorstehend näher charakterisierten transgenen Wirtszelle, zur biotechnologischen Herstellung von Acrylsäure und einen Biokatalysator zur Herstellung von Acrylsäure, enthaltend einen Träger und mindestens eine daran immobilisierte transgene Wirtszelle, die mindestens eine der vorstehend charakterisierten erfindungsgemäßen Decarboxylase-Aktivität exprimiert.

Die Erfindung sieht dazu ein Verfahren vor, wobei diese transgene Wirtszelle und/oder der Biokatalysator mit immobilisierter transgener Wirtszelle mit Fumarsäure, besonders mit Fumarsäure enthaltendem Medium, in Kontakt gebracht wird, so dass eine intrazelluläre Umsetzung der Fumarsäure zu Acrylsäure in den Zellen stattfindet. Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur Herstellung von Acrylsäure, welches, zumindest oder ausschließlich, aus den Schritten besteht: Bereitstellen einer transgenen Wirtszelle, welche mindestens eine der vorstehend charakterisierten Decarboxylase-Aktivitäten exprimiert, und Kultivieren der Wirtszelle in Kulturmedium, enthaltend das Substrat Fumarsäure, unter Bedingungen, unter denen das Substrat umgesetzt und Acrylsäure gebildet wird.

In einem optionalen weiteren Schritt wird das Produkt aus dem Kulturmedium und/oder der Zelle isoliert und gegebenenfalls aufgereinigt. Üblicherweise wird das intrazellulär gebildete Produkt aus der Zelle in das Extrazellulärmedium abgegeben.

Die Kultivierung findet bevorzugt in vorzugsweise flüssigem Kulturmedium statt. Es ist bevorzugt vorgesehen, die Zelle dabei unter anaeroben Bedingungen zu kultivieren. Je nach Wirtsorganismus ist es in einer alternativen Variante auch vorgesehen, die Zelle unter aeroben Bedingungen zu kultivieren. Anhand der vorstehenden Beschreibung der Erfindung kann der Fachmann die jeweils günstige Enzymausstattung wählen.

Gegenstand der Erfindung ist somit eine transgene Wirtszelle, welche mindestens ein Element ausgewählt aus: Nukleinsäuremolekül, bevorzugt in exprimierbarer Form, mindestens einer Expressionskassette, die das mindestens eine Nukleinsäuremolekül gegebenenfalls zusammen mit mindestens einem Promotor und gegebenenfalls einer Terminatorsequenz enthält, und mindestens einem Vektor, der mindestens eine solche Expressionskassette enthält. Bevorzugt ist dabei das Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Nukleinsäuremolekülen, welche mindestens eine der Sequenzen ausgewählt aus: SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 17, 19, 23, 25, 27 und 29 und deren komplementäre Sequenzen enthalten oder daraus bestehen; und b) Nukleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, welche mindestens eine Sequenz ausgewählt aus: SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 18, 20, 24, 26, 28 und 30 enthalten oder daraus bestehen kodieren:
Die Erfindung steht dabei auch im Zusammenhang mit für den Fachmann ohne erfinderisches Zutun auffindbare Nukleinsäuremoleküle, vor allem Fragmente und abgeleiteten Moleküle, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nukleinsäuremolekülen zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie oder Sequenzidentität aufweisen, wobei diese mindestens eine Decarboxylase-Aktivität, bevorzugt eine der vorstehend charakterisierten Decarboxylase-Aktivitäten kodieren.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung von Acrylsäure, welches zumindest oder ausschließlich die folgenden Schritte enthält: Bereitstellen einer transgenen Wirtszelle, welche mindestens eine der vorstehend charakterisierten Decarboxylase-Aktivitäten exprimiert, bevorzugt eine vorstehend charakterisierte Wirtszelle; und Kultivieren der Wirtszelle in Kulturmedium, enthaltend das Substrat Fumarsäure, unter Bedingungen, unter denen das Substrat umgesetzt und Acrylsäure gebildet wird.

In einer alternativen Variante dieses Erfindungsaspekts ist die erfindungsgemäße transgene Wirtszelle selbst ein Fumarsäure-Überproduzent, und sowohl die Synthese der Fumarsäure als auch deren erfindungsgemäße Umsetzung zu Acrylsäure findet in derselben Wirtszelle statt. Bevorzugte Beispiele sind hierbei Wirtszellen der Gattungen Escherichia und Pseudomonas. In einer alternativen Variante ist die Wirtszelle ausgewählt aus Fumarsäure bildenden Zellen, vor allem der Gattung Rhizopus.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung von Acrylsäure, welches zumindest oder ausschließlich die folgenden Schritte enthält: Bereitstellen einer Wirtszelle, die geeignet ist, Fumarsäure zu synthetisieren, und mindestens eine der vorstehend charakterisierten Decarboxylase-Aktivitäten exprimiert; und Kultivieren der Wirtszelle in Kulturmedium unter Bedingungen, unter denen Acrylsäure gebildet wird.

Bevorzugte Beispiele solcher Wirtszellen sind Organismen der Gattung Rhizopus, die eine homologe Enzymaustattung zur Synthese von Fumarsäure vorzugsweise aus C3-C6-Substraten, vor allem Glycerol und Glucose, enthalten und somit zur Fumarsäure-Produktion befähigt sind. Alternative Beispiele sind transgene Wirtszellen, die durch Expression heterologer Gene zur Fumarsäure-Produktion befähigt sind. Solche Wirtszellen dienen zweckmäßigerweise als Ausgangsorganismus für die Transfektion mit mindestens einer vorstehend charakterisierten Nukleinsäure, Expressionskassette oder Vektor, um die intrazellulare Decarboxylierung der gebildeten Fumarsäure zu Acrylsäure zu ermöglichen.

Die Erfindung und die Mittel zu ihrer Durchführung werden im Folgenden näher beschrieben, ohne dass die Erfindung auf die genannten konkreten Ausführungen beschränkt sein soll. Aufgrund der Struktur ihrer natürlichen Substrate und Produkte, sowie dem experimentellen Nachweis von Sequenz und rekombinanter Expression sind die folgenden Decarboxylasen für die Erfindung bevorzugt. Diese stellen auch die bevorzugten „Wildtypen” für erfindungsgemäß bevorzugte Modifikation zur Verbesserung der Enzymfunktion, besonders der Substratspezifität dar. Sie sind im anhängenden Sequenzprotokoll angeführt; das Sequenzprotokoll zeigt:
4-Oxalocrotonat-Carboxy-Lyase (EC 4.1.1.77) aus Pseudomonas sp. CF600, bevorzugt codiert durch ein Nucleinsäuremolekül mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder bevorzugt mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2;
ACMSD (EC 4.1.1.45) aus Pseudomonas fluorescens Stamm KU-7 (NCBI: Sequenz BAC65312.1, GI 28971629), bevorzugt codiert durch ein Nucleinsäuremolekül mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 3 und/oder bevorzugt mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4;
OPET-Decarboxylase (EC 4.1.1.68), ein monomeres Enzym aus Escherichia coli C pJJ801, bevorzugt codiert durch ein Nucleinsäuremolekül mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5 und/oder bevorzugt mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6;
Dihydroxyphthalat-Carboxylyase (EC 4.1.1.69) aus Arthrobacter keyseri 12B, bevorzugt codiert durch ein Nucleinsäuremolekül mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 7 und/oder bevorzugt mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 8;
Oxaloacetat-Carboxy-Lyase (EC 4.1.1.3) aus Clostridium glutamicum oder Lactococcus lactis subsp. lactis bv. diacetylactis (Stamm CRL 264), bevorzugt codiert durch ein Nucleinsäuremolekül mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 9 und/oder bevorzugt mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 10;
Acetoacetat-Decarboxylase (EC 4.1.1.4) aus Clostridium acetobutylicum ATCC 824, bevorzugt codiert durch ein Nucleinsäuremolekül mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 11 und/oder bevorzugt mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 12;
2,3-Dihydroxybenzoat-Decarboxylase (EC 4.1.1.46) aus Aspergillus niger CBS 513.88, bevorzugt codiert durch ein Nucleinsäuremolekül mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 13 und/oder bevorzugt mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 14;
Uroporphyrinogen-Carboxylyase (EC 4.1.1.37) aus Escherichia coli K-12 MG1655, bevorzugt codiert durch ein Nucleinsäuremolekül mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 15 und/oder bevorzugt mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 16;
Methylmalonyl-CoA-Decarboxylase (EC 4.1.1.41) Escherichia coli K-12 MG1655, bevorzugt codiert durch ein Nucleinsäuremolekül mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 17 und/oder bevorzugt mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 18;
Dihydroxyphthalat-Decarboxylase (EC 4.1.1.55) aus Pseudomonas putida (PHT plasmid), Pseudomonas fluorescens oder Pseudomonas testosteroni, bevorzugt codiert durch ein Nucleinsäuremolekül mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 19 und/oder bevorzugt mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 20;
Aryl-Methylmalonat-Decarboxylase (EC 4.1.1.76) aus Alcaligenes bronchisepticus (Bordetella bronchiseptica KU1201), bevorzugt codiert durch ein Nucleinsäuremolekül mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 21 und/oder bevorzugt mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 22;
Uracil-5-Carboxylat-Carboxylyase (EC 4.1.1.66) aus Neurospora crassa, bevorzugt codiert durch ein Nucleinsäuremolekül mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 23 und/oder bevorzugt mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 24;
4-Hydroxyphenylacetat-Carboxylyase (EC 4.1.1.83) aus Clostridium difficile (Stamm DSMZ 1296T), ein nach dem derzeitigen Kenntnisstand aus drei Untereinheiten bestehendes Enzym, bevorzugt codiert durch Nucleinsäuremoleküle mit den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 25, 27 und 29 und/oder bevorzugt mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 26, 28 und 30; und
4-Hydroxybenzoat-Carboxy-Lyase (EC 4.1.1.61) aus Clostridium hydroxybenzoicum oder Sedimentibacter hydroxybenzoicus (Stamm JW/Z-1) ein nach dem derzeitigen Kenntnisstand aus drei Untereinheiten bestehendes Enzym, bevorzugt codiert durch Nucleinsäuremoleküle mit den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 31, 33 und 35 und/oder bevorzugt mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 32, 34 und 36.

Ausgangspunkt für die Transformation war ein transgener E. coli-Stamm K12, welcher zur Überproduktion von Fumarsäure aus C3 bis C6-Substraten (Glucose, Glycerol) befähigt ist. Die Synthese sieht außerdem eine (Re-)Fixierung von CO2 in der Reaktion der PEP-Carboxylase vor.

Zur Realisierung der Decarboxylase-Aktivität wurden Expressionskassetten für Decarboxylase-Aktivität des Enzyms ACMSD (EC 4.1.1.45), enthaltend die SEQ ID NO: 3, in Expressionsvektoren pUC oder pPCU18 oder ähnlichen cloniert/ligiert.

Die Ligation der Plasmid-DNA erfolgte in an sich bekannter Weise. Beispielsweise wird der Vektor durch Hydrolyse mit Restriktionsendonuclease geöffnet und die entsprechenden DNA-Sequenzen inseriert. Die Ligation erfolgte beispielsweise durch Kassettenmutagenese. Die Transformation transformationskompetenter E. coli-Zellen sowie die Herstellung transformationskompetenter E. coli-Zellen erfolgte vorzugsweise nach dem Protokoll von Hanahan, 1985 (Hanahan, D. in Glover, D. M. (ed.) DNA Cloning: „A Practical Approach” IRL Press Oxford 109–135).

Die erhaltenen rekombinanten Zellen wurden nach Inokulation in einem 50 L-Fermenter mit Kulturmedium angesetzt und bei 25 bis 40°C kultiviert. Die Zugabe eines C3-C6-Substrates, vorzugsweise Glucose, und in einem alternativen Ansatz Glycerol, erfolgte direkt in das Kulturmedium.

Ausgangspunkt für Fumaratsynthese war ein transgener E. coli-Stamm K12, welcher zur Überproduktion von Fumarsäure aus C3 bis C6-Substraten (Glucose, Glycerol) befähigt ist. Die Synthese sieht außerdem eine (Re-)Fixierung von CO2 in der Reaktion der PEP-Carboxylase vor.

Die Zellen wurden nach Inokulation in einem 50 L-Fermenter mit Kulturmedium angesetzt und bei 25 bis 40°C kultiviert. Die Zugabe eines C3-C6-Substrates, vorzugsweise Glucose, und in einem alternativen Ansatz Glycerol, erfolgte direkt in das Kulturmedium.

Fumarat wurde von den Zellen direkt ins Kulturmedium abgegeben; der Transmembrantransport des intrazellulär gebildeten Fumarats wurde beispielsweise über einen Protonen-Symport vermittelt.

Ein modifiziertes Enzymprotein, welches von der SEQ ID NO: 4 (Aminocarboxymuconat-semialdehyd-Decarboxylase (EC 4.1.1.45)) abgeleitet wurde und an die Immobilisierung an einen Träger angepasst wurde, wurde mittels kovalenter Bindung an eine Trägermembran (Polycarbonat) gebunden.

Die Decarboxylierung des Fumarats erfolgte durch Inkontaktbringen des Kulturmediums nach erfolgter fermentativer Fumaratbildung extrazellulär mit dem gebundenen Enzymprotein.

Ergebnisse: Aus den Substraten Glucose und Glycerol lässt sich in hoher Ausbeute über die Zwischenstufe Fumarat Acrylat erhalten. Die extrazelluläre Decarboxylierung von Fumarat an dem immobilisierten Enzymprotein ist in ebenfalls hoher Ausbeute möglich.